*法凱氏定氮法
1 鎢酸沉淀法
本法系通過測定供試品的總氮含量以及經(jīng)鎢酸沉淀去除蛋白的供試品濾液中的非蛋白氮含量，計算出蛋白質(zhì)的含量。
供試品溶液的制備 （1）總氮測定溶液的制備精密量取供試品1ml，用*準確稀釋至每1ml含氮量約1mg。
（2）非蛋白氮測定溶液的制備精密量取供試品2ml，加水14ml、10%鎢酸鈉溶液2ml、硫酸溶液（1.86→100）2ml,搖勻，靜置30分鐘過濾，取濾液測定。
測定法 精密量取總氮測定溶液1ml，置凱氏定氮瓶中，照氮測定法（附錄Ⅵ A）測定供試品中總氮含量。同時做空白對照。
精密量取非蛋白氮測定溶液5ml，置凱氏定氮瓶中，照氮測定法（附錄Ⅵ A）測定供試品中非蛋白氮含量。
按下式計算
CTN（mg/ml）=（VX1-V0）×c×14.01×n×2
_________________________
V1
CNPN（mg/ml）=（VX2-V0）×c×14.01×n×2
_________________________
V2
CPN（mg/ml）=CTN-CNPN
供試品蛋白質(zhì)含量（%,g/ml）=CPN×6.25×100
_______________
1000
式中CTN為供試品溶液總氮含量，mg/ml;
CNPN為供試品溶液非蛋白氮含量，mg/ml;
VX1為供試品總氮測定溶液消耗酸滴定液的體積,ml;
VX2為供試品非蛋白氮測定溶液消耗酸滴定液的體積，ml;
V0為空白試驗消耗酸滴定液的體積，ml;
c為硫酸滴定液的濃度，mol/L；
CPN為供試品蛋白氮含量，mg/ml;
n為供試品的稀釋倍數(shù)；
V1為供試品總氮測定溶液的體積，ml；
V2為供試品非氮測定溶液的體積，ml；
14.01為氮的相對原子質(zhì)量；
6.25 為常數(shù)（1g氮相當于6.25g蛋白質(zhì)）。
【附注】（1）供試品蛋白質(zhì)含量如超過10%（g/ml），除蛋白質(zhì)時應(yīng)適當加大供試品稀釋倍數(shù)，10%鎢酸鈉溶液及硫酸溶液用量相應(yīng)地按比例增加，使溶液中的鎢酸濃度仍保持1%。
（2）總氮測定和非蛋白氮測定可用同一空白對照。
2 三氯醋酸沉淀法（新增）
本法系將供試品經(jīng)三氯醋酸沉淀，通過測定該沉淀中的蛋白氮含量，計算出蛋白質(zhì)的含量。
測定法 量取適宜體積的供試品（每1ml含蛋白質(zhì)為4-10mg）于適宜的尖底離心管中，加等體積的12%三氯醋酸（12→100）混勻，靜置30分鐘后，離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘），棄上清，用約3ml水分數(shù)次將沉淀洗入凱氏定氮瓶中，照氮測定法（附錄VI A）測定供試品中總氮含量，同時做空白對照。
按下式計算：
（VX-V0）×C×14.01×2
供試品蛋白質(zhì)含量（mg/ml）= —————————————×6.25
V
式中VX 為供試品消耗酸滴定液的體積，ml;
V0為空白試驗消耗酸滴定液的體積，ml;
C為硫酸滴定液的濃度，mol/L;
V 為供試品的體積，ml。
第二法Lowry法
本法用于微量蛋白質(zhì)的含量測定。蛋白質(zhì)在堿性溶液中可形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物, 此復(fù)合物加入酚試劑后, 產(chǎn)生藍色化合物, 該藍色化合物在650nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，根據(jù)供試品的吸光度，計算供試品的蛋白質(zhì)含量。
試劑（1）酚試劑 取鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g，置1500ml蒸餾瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、鹽酸100ml，上連回流管（使用木塞或錫紙包裹的橡皮塞）微沸回流10小時。取下回流管，加入硫酸鋰150g、水50ml、溴液幾滴，煮沸約15分鐘，驅(qū)除過量的溴。冷卻，加水至1000ml，過濾，為酚試劑貯備液。
酚試劑貯備液 用氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L）測定酸濃度，然后加水稀釋至相當于1mol/L鹽酸濃度。
（2）堿性銅溶液 取0.1mol/L酒石酸鉀溶液與0.04mol/L硫酸銅溶液各0.5 ml，4%碳酸鈉溶液與0.8%氫氧化鈉溶液各25 ml，搖勻，即得。本液應(yīng)臨用配制。
（3）氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L）的配制及標定 取氫氧化鈉適量，加水攪拌使溶解成飽和溶液，冷卻后，置聚乙烯塑料瓶中，靜止數(shù)日，澄清后，取澄清的氫氧化鈉飽和溶液28ml，加新煮沸后冷卻的水，使成1000ml，搖勻。
取在105℃干燥至恒重的基準鄰苯二甲酸氫鉀約3g，精密稱定，加新沸過的冷水50ml，振搖，使其盡量溶解；加*指示劑2滴，用本液滴定；在接近終點時，應(yīng)使鄰苯二甲酸氫鉀*溶解，滴定至溶液顯粉紅色。每1ml氫氧化鈉滴定液相當于102.1mg的鄰苯二甲酸氫鉀。根據(jù)本液的消耗量與鄰苯二甲酸氫鉀的取用量，算出本液的濃度。
標準蛋白質(zhì)溶液的制備 取*標準品一支，用水定量稀釋至每1ml含1mg，作為貯備液。精密量取貯備液2.5ml置25ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即為每1ml含100μg的標準蛋白質(zhì)溶液。
測定法 精密量取一定體積供試品（含蛋白質(zhì)50μg左右）置試管內(nèi)，加水至1ml，加堿性銅溶液5ml,搖勻，室溫放置10分鐘, 快速加入酚試劑0.5 ml，搖勻，室溫放置30分鐘，顯色后，照紫外-見分光光度法（附錄Ⅱ A），在波長650nm處測定吸光度（呈色后，如發(fā)現(xiàn)渾濁，經(jīng)每分鐘3000轉(zhuǎn)離心15分鐘后，取上清液測定）。精密量取標準蛋白質(zhì)溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分別置于試管中，自“加水至1ml”起，同法操作。準確量取水1ml，自“加堿性銅溶液5ml”起，同法操作，作空白對照。以標準曲線的蛋白質(zhì)濃度對應(yīng)其吸光度，求直線回歸方程；將測得供試品的吸光度代入直線回歸方程，即得供試品的蛋白質(zhì)含量。
第三法 雙縮脲法
本法系依據(jù)蛋白質(zhì)肽鍵在堿性溶液中與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，利用標準蛋白質(zhì)溶液作對照，采用紫外-可見分光光度法測定供試品蛋白質(zhì)含量。
試劑 雙縮脲試劑。取硫酸銅（CuSO4·5H2O）3.0g、酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）9.0g、*5.0g、氫氧化鈉24g，加水溶解并稀釋至1000ml，搖勻，即得。
標準蛋白質(zhì)溶液的制備 精密量取*標準品適量，用水定量稀釋成每1ml 含50mg的溶液。
供試品溶液的制備 精密量取適量的供試品，加水制成每1ml約含50mg的溶液。
測定法 分別精密量取供試品溶液與標準蛋白質(zhì)溶液各0.05ml置玻璃試管中，分別加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，置37℃水浴中30分鐘，照紫外-可見分光光度法（附錄Ⅱ A），在波長540nm處測定吸光度。另精密量取水0.05ml，自“加雙縮脲試劑4.0ml”起，同法操作，作為空白對照。
按下式計算
蛋白質(zhì)含量（mg/ml）= A1×c×n
——————
A2
式中A1為供試品溶液的吸光度；
A2為標準蛋白質(zhì)溶液的吸光度；
c為標準蛋白質(zhì)溶液的濃度，mg/ml；
n為供試品稀釋倍數(shù)。
【附注】本法的測定范圍為1～10mg。
在線客服